اثر مورفین بر تکثیر ویروس هرپس سیمپلکس نوع 1 و 2
نویسندگان:
مناوری ش.ح.، شمسی‌شهرآبادی م.
چکیده:
اثر مورفین بر تکثیر ویروس هرپس سیمپلکس
زمینه و اهداف: چندین دارو برای درمان عفونت HSV در انسان استفاده می‌شوند اما هنوز معرفی یک داروی موثر و ایمن مطلوب است.
روش ها: ما اثر مهاری مورفین بر تکثیر HSV را در آزمایشگاه بررسی کردیم.
نتایج: نتایج نشان داد که غلظت تا 200 میکروگرم در میلی لیتر مورفین تاثیر محدودی بر زنده مانی سلول‌های Vero دارد. در این غلظت، رشد HSV به طور قابل توجهی مهار شد و پس از گذر سوم در حضور مورفین به طور کامل از بین رفت.
وجود آنتی ژن‌های ویروسی در سلول های آلوده در حضور مورفین با رنگ آمیزی IF نشان داد که پس از اولین گذر، تعداد کمی از سلول های آلوده حاوی پروتئین‌های ویروسی بودند و در گذر سوم هیچ سلولی با آنتی ژن ویروسی مشاهده نشد.
نتیجه‌گیری: این نتایج با تکنیک های صفحه و ایمونوبلاتینگ تایید شد. مشاهده با میکروسکوپ الکترونی در مقاطع سلولی نشان داد که هیچ ویروسی در سلول های درمان شده وجود ندارد در مقایسه با سلول‌های آلوده نشده کنترل.
کلیدواژه‌ها: ویروس هرپس سیمپلکس؛ مورفین؛ سمیت سلولی
مقدمه:
ویروس هرپس سیمپلکس نوع 1 و 2 به خانواده آلفا-هرپس‌ویریده تعلق دارند. ژنوم HSV دارای DNA دو رشته‌ای است که بیش از 70 محصول ژنی را کد می‌کند.
عفونت HSV شایع ترین عفونت‌های ویروسی در انسان است و طیف وسیعی از بیماری ها را ایجاد می‌کند. داروهای ضد ویروسی متعددی علیه عفونت‌های HSV مؤثر هستند که بیشتر آنها سنتز DNA ویروسی را مهار می‌کنند.
اخیراً، پزشکان و محققان با مشکل درمان طولانی‌مدت با آسیکلوویر به دلیل تشکیل جهش‌های مقاوم به دارو و سمیت دارو مواجه شده‌اند. مقاومت بیشتر در بیماران دارای نقص ایمنی گزارش شده است (حدود 5 درصد) و به ویژه در بیماران پیوند مغز استخوان (حدود 30 درصد) شایع است.
مقاومت به ACV با جهش در یکی از دو آنزیم ویروسی درگیر در فعال‌سازی ACV: تیمیدین کیناز (TK) و DNA پلیمراز مرتبط است. در 95 درصد موارد، مقاومت به ACV با جهش در ژن TK همراه است زیرا این آنزیم برای تکثیر ویروسی ضروری نیست، برخلاف DNA پلیمراز ویروسی. به نظر می‌رسد روش درمانی جایگزین برای عفونت HSV با استفاده از یک داروی جدید موثر مورد نیاز است.
نشان داده شده است که مورفین پتانسیل جلوگیری از پاتوژنز HSV را در برخی از حیوانات آزمایشگاهی دارد. هدف اصلی این مطالعه تعیین اثر مهاری مورفین بر تکثیر و رشد HSV در آزمایشگاه و بررسی امکان استفاده از آن برای درمان عفونت HSV بود.
روش‌ها:
کشت سلولی و ویروس:
کشت سلولی:
سلول‌های Vero (سلول‌های کلیه میمون سبز آفریقایی) در ظروف پلاستیکی یکبار مصرف یا در پلیت‌های 24 خانه‌ای کشت داده شدند.
محیط کشت مورد استفاده DMEM (محیط دال‌بیکو اصلاح شده ایگل) بود که با 8 درصد سرم جنین گاوی (FBS)، 100 واحد در میلی‌لیتر پنی‌سیلین، و 100 میکروگرم در میلی‌لیتر استرپتومایسین تکمیل شده بود.
ویروس:
ویروس هرپس سیمپلکس نوع 1 (HSV-1) از یک بیمار جدا شده و با استفاده از آنتی‌بادی‌های مونوکلونال خاص ضد HSV-1 شناسایی شد.
تیتر ویروس در سلول‌های Vero توسط آزمایش پلاک و روش TCID50 تعیین شد. تیتر ویروس معادل 5 × 10^6 PFU/ml (واحد تشکیل پلاک در میلی‌لیتر) بود.
تعیین سمیت مورفین:
تعیین غلظت غیرسمی مورفین:
غلظت‌های مختلفی از مورفین برای تعیین غلظت غیرسمی برای سلول‌های Vero استفاده شد.سلول‌ها در پلیت‌های 24 خانه‌ای کشت داده شده و در معرض غلظت‌های مختلف مورفین (100، 150، 200، 250، و 300 میکروگرم در میلی‌لیتر) قرار گرفتند.
پس از 48 ساعت، سلول‌ها با روش جذب قرمز خنثی ارزیابی شدند.غلظت غیرسمی مورفین 200 میکروگرم در میلی‌لیتر تعیین شد.
اثر مورفین بر تکثیر ویروس:
آزمایش اثر ضد ویروسی مورفین:
سلول‌های Vero در پلیت‌های 24 خانه‌ای کشت داده شده و به مدت یک ساعت با HSV-1 در MOI (مولتی‌پلیسیتی آو اینفکشن) برابر با 0.01 عفونی شدند.
پس از زمان جذب، سلول‌ها شسته شده و محیط کشت تازه حاوی مقادیر مختلف مورفین (100، 150، و 200 میکروگرم در میلی‌لیتر) اضافه شد.سلول‌ها به مدت 48 ساعت انکوبه شدند و سپس تیتر ویروس در سوپ‌رنانت‌ها با استفاده از آزمایش پلاک و TCID50 تعیین شد.
آنالیزهای تکمیلی:
ایمونوفلورسانس (IF):
برای تعیین حضور آنتی‌ژن‌های ویروسی در سلول‌های آلوده، سلول‌ها پس از گذرهای مختلف در حضور مورفین با استفاده از روش ایمونوفلورسانس (IF) رنگ‌آمیزی شدند.
سلول‌ها با آنتی‌بادی مونوکلونال ضد HSV-1 رنگ‌آمیزی شده و با میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شدند.
ایمونوبلاتینگ:
برای تایید نتایج، پروتئین‌های ویروسی از سلول‌های آلوده استخراج شده و با استفاده از روش ایمونوبلاتینگ شناسایی شدند.
پروتئین‌ها با آنتی‌بادی‌های خاص HSV-1 و روش‌های الکتروفورز ژل پلی‌آکریل‌آمید (SDS-PAGE) و انتقال به غشا شناسایی شدند.
میکروسکوپ الکترونی:
برای مشاهده مستقیم ذرات ویروسی، سلول‌های آلوده با میکروسکوپ الکترونی بررسی شدند.
سلول‌ها پس از گذرهای مختلف در حضور مورفین با میکروسکوپ الکترونی ترانسمیشن (TEM) مشاهده شدند.
آزمون PCR:
تعیین حضور DNA ویروسی:
تمام نمونه‌ها با استفاده از روش Real Time PCR برای حضور DNA HSV-1 آزمایش شدند.PCR با استفاده از پرایمرها و پروب‌های خاص برای تشخیص DNA HSV-1 انجام شد.
نتایج:
تعیین غلظت غیرسمی مورفین:
غلظت بهینه مورفین که برای سلول‌های Vero غیرسمی بود، با استفاده از جذب قرمز خنثی در حضور مقادیر مختلف مورفین تعیین شد.
مشخص شد که غلظت 200 میکروگرم در میلی‌لیتر برای سلول‌های Vero غیرسمی است.غلظت مورد استفاده برای سلول‌های آلوده به HSV از 150 میکروگرم در میلی‌لیتر تجاوز نکرد.
اثر مورفین بر تولید ویروس:
اثر ضد ویروسی مورفین با افزودن مقادیر مختلف مورفین (زیر دوز سمی) به سلول‌های آلوده به HSV پس از زمان جذب و تعیین مقدار ویروس عفونی تولید شده پس از 48 ساعت با هر دو روش TCID50 و آزمایش پلاک تعیین شد.
همانطور که در شکل 2 نشان داده شده است، تیتر ویروس تولید شده در حضور مورفین 2 لگاریتم کاهش یافت اما رشد ویروس به‌طور کامل مهار نشد.
پس از گذر سوم در حضور مورفین، تولید ویروس به‌طور کامل مهار شد.
ایمونوفلورسانس (IF):
رنگ‌آمیزی ایمونوفلورسانس نشان داد که پس از گذر اول، تعداد کمی از سلول‌های آلوده حاوی پروتئین‌های ویروسی بودند.
در گذر سوم، هیچ سلولی با آنتی‌ژن ویروسی مشاهده نشد.
ایمونوبلاتینگ:
نتایج ایمونوبلاتینگ نشان داد که پس از درمان با مورفین، میزان پروتئین‌های ویروسی به‌طور قابل توجهی کاهش یافت.هیچ باند پروتئینی ویروسی در گذر سوم مشاهده نشد.
میکروسکوپ الکترونی:
مشاهده با میکروسکوپ الکترونی در مقاطع سلولی نشان داد که هیچ ویروسی در سلول‌های درمان شده وجود ندارد.در مقابل، سلول‌های آلوده نشده کنترل حاوی تعداد زیادی ویروس بودند.
آزمون PCR:
تمام نمونه‌ها با روش Real Time PCR برای حضور DNA HSV-1 آزمایش شدند.
نتایج نشان داد که در سلول‌های درمان شده با مورفین، DNA ویروسی به‌طور قابل توجهی کاهش یافته است.
در گذر سوم، هیچ DNA ویروسی در سلول‌های درمان شده مشاهده نشد.
این نتایج نشان می‌دهد که مورفین در غلظت‌های غیرسمی می‌تواند به‌طور موثری تکثیر ویروس HSV را مهار کند و پس از چند گذر، ویروس را به‌طور کامل از بین ببرد. این اثرات هم با روش‌های کمی و هم با مشاهده مستقیم تایید شده‌اند.
بحث:
گزارش شده است که مورفین می‌تواند پاتوژنز HSV را در موش‌ها جلوگیری کند و مرگ و میر پس از عفونت چشمی با HSV-1 را کاهش دهد.
ما اثر مهاری مورفین بر رشد و تکثیر HSV در سلول‌های Vero را بررسی کردیم. اولین گام تعیین غلظت مورفینی بود که بر زنده‌مانی سلول‌های Vero غیرآلوده تأثیر نمی‌گذاشت.
تشکر و قدردانی:
نویسندگان از “دانشگاه علوم پزشکی ایران” برای حمایت مالی از این پروژه تشکر می‌کنند.
جداول و شکل‌ها:
شکل 1: اثر مورفین بر زنده‌مانی سلول‌های Vero
این شکل نشان می‌دهد که غلظت‌های مختلف مورفین چگونه بر زنده‌مانی سلول‌های Vero تأثیر می‌گذارند. نتایج نشان می‌دهد که غلظت 200 میکروگرم در میلی‌لیتر برای سلول‌ها غیرسمی است.
| غلظت مورفین (μg/ml) | درصد زنده‌مانی سلول‌های Vero |
|---|---|
| 100 | 100% |
| 150 | 100% |
| 200 | 95% |
| 250 | 70% |
| 300 | 50% |
شکل 2: اثر مورفین بر تولید ویروس در سلول‌های آلوده به HSV
این شکل نشان می‌دهد که تیتر ویروس تولید شده در حضور مورفین چگونه تغییر می‌کند. تیتر ویروس با افزایش غلظت مورفین کاهش می‌یابد و پس از گذر سوم در حضور مورفین به‌طور کامل مهار می‌شود.
| غلظت مورفین (μg/ml) | تیتر ویروس (PFU/ml) |
|---|---|
| 0 | 5 × 10^6 |
| 100 | 1 × 10^6 |
| 150 | 5 × 10^5 |
| 200 | 1 × 10^4 |
شکل 3: درصد سلول‌های آلوده حاوی آنتی‌ژن HSV پس از گذرهای مختلف
این شکل نشان می‌دهد که درصد سلول‌های آلوده حاوی آنتی‌ژن HSV با گذشت زمان و افزایش تعداد گذرها در حضور مورفین کاهش می‌یابد.
| تعداد گذرها | درصد سلول‌های آلوده حاوی آنتی‌ژن HSV |
|---|---|
| 1 | 10% |
| 2 | 2% |
| 3 | 0% |
