چكيده
زمينه و هدف: براساس پژوهشهاي انجامشده، ويروسها از عوامل شايع در بروز عفونتهاي چشمي كودكان و بزرگسالان ميباشند. از شايعترين اين عوامل ويروسي مي ها توان به هرپس سيمپلكس ويروس، آدنوويروس و انتروويروس اشاره نمود. در اين ميان ويروس هرپس سيمپلكس تيپ 1 ، عامل 90- %60 عفونتها در بزرگسالان است، و در عود حملات منجر به كراتيت هرپسي شده كه علت اكثر نابيناييها در كشورهاي در حال توسعه ميباشد؛ لذا تشخيص سريع جهت درمان ضروري است. اين بررسي نيز با هدف تعيين شيوع عفونتهاي كونژنكتيويت هرپس سيمپلكس ويروس در بيماران مراجعه كننده به بيمارستانهاي وابسته به دانشگاه علوم پزشكي تهران در سال 1388 صورت گرفت.
روش بررسي: اين مطالعه بهصورت توصيفي – مقطعي، بر روي 100 بيمار با تابلوي باليني كونژنكتيويت ويروسي انجام شد. نمونهها در محيط انتقالي جمع آوري و در محيط كشت سلولي تلقيح شدند. اثرات سايتوپاتيك ويروس با كشت سلولي كنترل مقايسه و جهت تأييد نتايج، تكنيك PCR به كار برده شد. تجزيه و تحليل دادهها با استفاده از آزمون كاي – اسكوئر صورت گرفت و 05/0 >p معني دار در نظر گرفته شد.
يافته ها: از تعداد 100 نمونه مورد بررسي، 2 مورد ( 2%) توسط كشت سلول هرپس سيمپلكس ويروس ايزوله و بهوسيله روش PCR، در 9 مورد (%9) DNA ويروس رديابي شد. بيشترين فراواني بيماران با HSV مثبت، در گروه سني 26-6 سال ( 5/ %13) قرار داشت. تفاوت معني داري بين سن جنس در ابتلا به كنزنكتيويت هرپسي مشاهده نشد.
نتيجه گيري: نتايج اين مطالعه نشان داد عفونتهاي چشمي هرپسي عامل اصلي نابينايي است، و با توجه به عود مكرر عفونت، صدمات متعاقب آن و تشابهات باليني با ساير عفونتها ضروري به نظر ميرسد، تا با تشخيص سريع و اختصاصي HSV صورت گرفته از درمان نامناسب بيماران اجتناب شود.
مقدمه
هرپس سيمپلكس ويروس تيپ ( 1 -1HSV( ، ويروس DNAدار 2 رشتهاي خطي است كه متعلق به زيرخانواده α هرپس ويرينه و خانواده هرپس ويريده است )3-1( . براساس پژوهشهاي انجام شده در بسياري از كشورها، ويروسها يكي از عوامل شايع
در بروز عفونتهاي چشمي در كودكان و بزرگسالان ميباشند (6-4 ). عفونت چشمي ناشي از هرپس سيمپلكس تيپ با 1 شيوع ساليانه بين 7/ 20-9/5 در 100000 نفر در سال، گزارش شده است (7 ). در چشم پزشكي كونژنكتيويت و كراتيت دو شكل رايج بيماريهاي چشمي ميباشند (4). التهاب ملتحمه (كونژنكتيويت) ويروسي عفونت شايع چشمي است كه ميتواند توسط برخي از عوامل ويروسي ايجاد شود. شدت اين بيماري از شديد تا عفونت خفيف سريعاٌ محدودشونده، متفاوت است (5،6). كونژنكتيويت
همراه با پرخوني خفيف با ريزش اشك تا التهاب ملتحمه شديد به همراه ترشحات چركي متغير ميباشد (5،6). از علائم مهم كونژنكتيويت احساس جسم خارجي در چشم، احساس خراشيدگي، سوزش، خارش و فتوفوبي همراه با پرخوني ملتحمه
است، درصورت احساس درد، درگير بودن قرنيه نيز مطرح ميباشد (8). عود حملات هرپسي غالباٌ به كراتيت تبديل ميشود )8،( كه در اين حالت حدود %10 از بيماران داراي علائم كلينيكي هستند (9). كراتوكونژنكتيويت ويروسي، درگيري توأم قرنيه و
ملتحمه بوده كه در بيشتر موارد به علت فعاليت هرپس سيمپلكس ويروس و آدنوويروسها در برخي از عفونتها ناشي از سرخك مشاهده ميشود (1،10). كراتيتهاي ناشي از هرپس سيمپلكس ويروس خصوصاٌ تيپ 1 ، شايعترين نوع كراتيت ويروسي است كه
عامل مهم اكثر نابيناييها در كشورهاي در حال توسعه شناخته شده است (8،1)، همچنين شايعترين علت زخم قرنيه و كوري در ايالت متحده آمريكا ميباشد ( 11،2). در نهايت تشخيص سريع ودرست براي شروع درمان سريع و مناسب ضروري به نظر ميرسد (12). از تستهاي آزمايشگاهي در تشخيص هرپس سيمپلكس ويروس ميتوان به سيتولوژي سلولي، رديابي آنتيژن ويروسي (ايمونواسي)، جداسازي ويروس توسط كشت سلول، رديابي اشاره ISH (In Situ Hybridisation) و PCR ويروس DNA
نمود كه اين تكنيكها از نظر حساسيت و اختصاصي بودن متفاوت هستند (13،4). اگرچه لزيونهاي قرنيه و كوتانئوس ايجادشده تيپيك و خاص ميباشد، ولي بايستي هرپس سيمپلكس ويروس جداسازي و رديابي شود. با توجه به مطالعات معدودي كه
در مورد اپيدميولوژي هرپس سيمپلكس ويروس انجام گرفته است (9 )، عود مكرر عفونتها و صدمات وارده بر اثر اين ويروس به چشم، ايجاب مي ع كند كه مورد بررسي قرار گيرد. همچنين به لت مشابه بودن تظاهرات بيماري چشمي ناشي از هرپس سيمپلكس ويروس با ديگر عفونتها، ضروري است تا با تشخيص سريع و اختصاصي هرپس سيمپلكس ويروس از درمان نامناسب بيماران اجتناب شود (14). در اين مطالعه نيز جهت تشخيص هرپس سيمپلكس ويروس بر روي نمونه هاي اشك گرفته شده از بيماران با تابلوي باليني كونژنكتيويتي ويروسي از تكنيك كشت سلول و Reaction Chain Polymerase ) PCR)جهت تأييد آن استفاده بگرديد.
روش بررسی
اين بررسي به روش توصيفي – مقطعي بر روي 100 بيمار حداقل 5/1 و حداكثر 70 ساله با تابلوي باليني كونژنكتيويتي ويروسي مراجع هكننده به بيمارستانهاي وابسته به دانشگاه علوم پزشكي ايران انجام گرفت. پس از تهيه و تنظيم پرسشنامه، توسط پزشك متخصص در درمانگاه مربوطه با استفاده از سواب پنبهاي نرم استريل از ملتحمه بيماران و قطرات اشك نمونهگيري شد و به محيط انتقالي (Medium Transport Viral (در حجم ml 2 كه قبلاٌ در آزمايشگاه ساخته شده بود، منتقل گرديد. براي هر بيمار 2 سواب پنبهاي استريل، يكي جهت روش PCR و ديگري براي تكنيك كشت سلول در نظر گرفته شد. تمامي نمونههاي جمعآوريشده قبل از هرگونه درمان، ضد ويروسي شده و در ظروف حاوي يخ خشك پس از انتقال به بخش ويروسشناسي دانشگاه علوم پزشكي ايران تا زمان آزمايش در فريزر C° 70- نگهداري شدند. براي جداسازي ويروس، از محيط كشت ( Dubleccos΄ Modified Eeagle Medium ) DMEM ساختهشده از رده سلولي كليه ميمون سبز آفريقايي (Vero (كه قادر به تحمل پاساژهاي مكرر و حساس براي رشد و تكثير ويروس هرپس سيمپلكس ميباشد، استفاده گرديد ( 12). براي اين منظور ابتدا سلولها بعد از رشد در فلاسكهاي يكبار مصرف كشت سلولي Nunc، جهت انجام آزمايش و تلقيح نمونه هاي بيماران به ميكروتيوپهاي 24 خانه اي يكبار مصرف انتقال داده شدند. در ادامه، پس از تشكيل منولاير سلولي از سلول Vero نمونه بيماران به آنها تلقيح گرديد و به مدت يك ساعت در C° به 37 منظور جذب ويروسها انكوبه شدند. سپس محيط كشت سلولي جديد همراه با سرم جنين گاو (%8 FBS (خريداري شده از دانشكده دامپزشكي دانشگاه تهران، بر روي بستر سلولهاي آلوده به ويروس اضافه شد. در مرحله بعد، ميكروپليتها در انكوباتوري با شرايط C° 5و 37 % 2CO و رطوبت %95 قرار داده شدند. به منظور مشاهده اثرات سايتوپاتيك ويروس (CPE(، يك خانه جهت كنترل مثبت (آلوده با بذر ويروس هرپس سيمپلكس تيپ 1 كه قبلاٌ از بيمار جدا شده و در آزمايشگاه توسط منوكلونال آنتيبادي برعليه -1HSV تعيين تيپ شده بود ) و يك خانه جهت كنترل منفي (كنترل شاهد سلولي) كه آلوده به ويروس نبود، در نظر گرفته شد و تمام مراحل فوق بر روي آنها صورت گرفت. سپس هر روز تا 48 ساعت كشتهاي سلولي حاوي نمونه ها جهت اثرات سايتوپاتيك حاصل از ويروس هرپس سيمپلكس در مقايسه كشت سلولي كنترل منفي و كنترل مثبت، به وسيله ميكروسكوپ معكوس (Invert (بررسي شدند ( )12. جهت تأييد نتايج مثبت و منفي كشت سلول از تكنيك PCR استفاده گرديد. به علت آنكه امكان غيرفعال شدن ويروس تا زمان انجام آزمايش وجود داشت؛ لذا در كنار تكنيك كشت سلول، PCRنيز گذاشته شد. جهت جداسازي و استخراج DNA يها ويروس، نمونه گرفته شده به مدت 10 دقيقه جوشانده شدند، سپس تكنيك PCR توسط كيت خريداري شده از شركت تكاپو زيست و توسط ترموسايكلر 40 Robocycler بر روي تمامي نمونه ها انجام گرديد. سيكل PCR جهت -1HSV داراي مراحل زير يم باشد : ابتدا 3 دقيقه در C° 95 يك سيكل (جداسازي اوليه)، سپس 40 سيكل كه شامل 3 مرحله م يباشد: C° ؛ 95 30 ثانيه، C° ؛50 30 ثانيه، C° ؛72 30 ثانيه و مرحله نهايي 3 دقيقه در C° 72 يك سيكل
یافته ها
توزيع فراوان ي ها نمونه ي جمعآوريشده از 100 بيمار برحسب ماه هاي مختلف در تصاوير نمايش داده شده است. 5/ %87 بيماران دچار پرخوني، درد و ريزش اشك بودند. در %75 خارش و تحريك ، 68/8 % ادم، 2/ %31 فوليكولي و 2/6 % فارنيت مشاهده گرديد.
از مجموع 100 بيمار نمونه برداري شد ه، 59 نفر مرد و 41 نفر زن با ميانگين سني 8/ 33 سال بودند. عفونت ناشي از هرپس سيمپلكس ويروس در افراد مذكر با 7 مورد ( 7/ %77) نسبت به افراد مونث با 2 مورد ( 2/ %22) بالاتر گزارش شد بي. ن جنس و سن (جدول) با ابتلا به عفونت و يروس هرپس سيمپلكس تيپ از 1، نظر آماري اختلاف معنيدار ي وجود نداشت.
بحث
بسياري از ميكروارگانيسمها به ويژه ويروسها در بروز اشكال ها عفونت ي چشمي انسان شناسايي شده اند، كه از شایع ترین آنها میتوان هرپس ويروسها، آدنوويروسها و انتروويروسها را نام برد (11). پيدايش هرگونه اختلال در عمل طبيعي اپيتليوم قرنيه، چشم را براي كراتيت مستعد می كند. اگرچه كراتو كونژنكتيويت در ايران هم همانند بسياري از ديگر كشورهاي در حال توسعه يك مشكل شايع و مهم میباشد، ولي تحقيقات اندكي راجع به آن در ايران صورت گرفته است. در اين پژوهش از مجموع 100 نمونه چشمي جمع آوري شده از مبتلايان به كونژنكتيويت ،2 % پس از كشت و 9% بعد از PCR از نظر ويروس هرپس سيمپلكس تيپ 1 مثبت گزارش شدهاند كه كمي بالاتر از نتايج ديگر مطالعات ميباشد، به طوريكه در تحقيق تميزيفر و همكارانش در سال ،1381 فراواني آن ، )8( 2% در مطالعه مدرسي و همكارانش در سالها ي 1374-1376 ( 4/1% ، )11 و در پژوهشي كه در كراچي طي سالهاي 1990-1992 انجام گرفت، ( 3/2% 15) گزارش گرديد . اگرچه روش كشت سلول روش استاندارد طلايي جهت رديابي عفونت فعال -1HSV است ، اما ميتواند تكنيك غيرحساسي نيز براي جداسازي -1HSV از لا يه هاي عمیق قرنيه باشد و از طرفي، ممكن است قادر به رديابي عفونت نيز نباشد (13). جداسازي ويروس توسط تكنيك كشت سلول نياز به ارگانيسم زنده ، فعال و محيط انتقالي ويروس جهت انتقال سريع به آزمايشگاه دارد، همچنين فاصله بين نمونه گيري از بيماران و انتقال به آزمايشگاه و قراردادن نمونه ها در دماي مناسب بايد سريع انجام شود كه اين روند معمولاٌ سخت و وقتگير است. در حقيقت، احتمالاٌ علت كاهش فراواني ويروس جداشده توسط تكنيك كشت سلول به دلايل بالا بوده كه امكان غيرفعال شدن ويروس تا زمان انجام آزمايش را موجب ميشود. مطالعات ديگر محققين نيز در اين زمينه صحت مطالب بالا را تأييد ميكند. به عنوان مثال در پژوهش توسط 1E-MA و همكارانش در سال ،2005 از 48 مورد تنها 10 مورد به وسيله كشت سلول جدا شد ( و )12 در مطالعه اي كه توسط خدادوست و همكارانش در سال 2004 انجام گرفت از 25 مورد تنها 3 مورد توسط كشت سلول جدا گرديد . )4( همچنين در مطالعه Eiichi و همكارانش در سال 2000 ، از 478 مورد 23 مورد گزارش شد )6( و در تحقيق Pramod و همكارانش در سال 1998 از مو 70 ،رد 14 مورد توسط كشت سلول جدا گرديد ( . )16 (PCR يك روش تشخيصي حساس و سريع آزمايشگاهي جهت شناسايي هرپس و ها يروس ميباشد) ( 17). در مقايسه اين مطالعه با پژوهش های ديگر ي كه در آنها از تكنيك PCR جهت رديابي DNA هرپس ویروس ها استفاده شده بود مثل پژوهش توسط 1E-MA د ر سال 2005 ، اين فراواني 2/ %29 گزارش گرديد ( )12 . در پژوهش خدادوست و همكارانش نيز در سال 2004 ، %88 -1HSV DNA يها در نمونه گرفته شده از قطرات اشك بيماران رديابي شد )4( كه نشان دهنده حساس بودن اين تكنيك جهت رديابي -1HSV DNA در قرنيه و قطرات اشك ميباشد، نتايج به دست آمده نيز مبين غيرفعال شدن ويروس بود كه توسط كشت سلول قابل شناسايي نبود، ولي با استفاده از PCR، DNA ويروس رديابي شد. با مقايسه نتايج كسب شده از اين مطالعه با تحقيقات ديگر ميتوان به اين نتيجه دست يافت كه اندكي اختلاف بين يافته هاي فوق از نظر شيوع كونژنكتيويت در مناطق مختلف جهان وجود دارد كه خود گوياي تفاوت جغرافيايي و بهداشتي اين مناطق با ديگر نقاط است.
نتیجه گیری
عفونتهاي ناشي از هرپس سيمپلكس ويروس به دو صورت فعال و عودشونده ميتواند وجود داشته باشد. با توجه به اينكه عفونتهاي چشمي ناشي از هرپس سيمپلكس ويروس منجر به درگيري توأم قرنيه و ملتحمه ميشود و عود حملات هرپسي غالباٌ به كراتيت هرپسي قابل تبديل است (8)، همچنين كراتيتهاي ناشي از اين ويروس خصوصاٌ تيپ 1 ، عامل مهم اكثر نابيناييها در كشورهاي در حال توسعه ميباشد؛ لذا ضرورت تشخيص صحيح و درست جهت شروع درمان سريع و مناسب بايد مورد توجه بيشتري قرار گيرد.
