عفونت در بیماران ایرانی با بیماری‌های عصبی

عفونت در بیماران ایرانی با بیماری‌های عصبی؛

نویسندگان:
سید حمیدرضا منواری، سمیله نوربخش، فریده ابراهیمی تاج، حمیدرضا مولایی، مهدی فضل‌علی‌پور، مصطفی صالحی وزیری

مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی کودکان، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران
بخش ویروس‌شناسی، دانشگاه علوم پزشکی تهران، تهران، ایران

چکیده:

التهاب مغزی و مننژیت در کودکان و بزرگسالان به طور متداول رخ می‌دهد. در این مطالعه حضور DNA ویروس هرپس انسانی نوع 6 (HHV-6) و نوع 7 (HHV-7) در نمونه‌های مایع مغزی-نخاعی (CSF) گرفته‌ شده از کودکان ایرانی که از مننگوآنسفالیت رنج می‌بردند، بررسی شد.
از سال 2007 تا 2009، 150 بیمار از تهران که به دلیل مننگوآنسفالیت به بخش اطفال بیمارستان رسول اکرم، تهران، ایران، مراجعه کرده بودند، در این مطالعه شرکت داشتند. روش‌های متداول و محیط کشت BACTEC Ped Plus به همراه تست آگلوتیناسیون لاتکس و PCR واقعی برای تشخیص DNA ویروس‌های HHV-6 و HHV-7 در نمونه‌های بالینی استفاده شد.
در 12٪ (18/150) از موارد، DNA تمامی انواع ویروس هرپس انسانی شناسایی شد. DNA ویروس HHV-6 در 4.7٪ و DNA ویروس HHV-7 در 2 مورد (1.4٪) شناسایی شد. DNA ویروس‌های هرپس انسانی نوع 6 و 7 در 6٪ از تمام موارد مورد مطالعه شناسایی شدند.
ویروس HHV-6 کمی بیشتر از HHV-7 مشاهده شد. یافته‌های ما کمتر از نرخ سایر منابع بود اما بالاتر از یافته‌های مطالعه قبلی در ایران بود. این تفاوت ممکن است به دلیل تفاوت در روش‌ها، سن موارد مطالعه یا تفاوت‌های اپیدمیولوژیک و جغرافیایی باشد.

کلمات کلیدی:

مننژیت ویروسی، مایع مغزی-نخاعی، CSF، ویروس هرپس انسانی نوع 6، ویروس هرپس انسانی نوع 7، ایران

مقدمه:

مننگوآنسفالیت اغلب در کودکان رخ می‌دهد، اما انسفالیت که یک بیماری تهدیدکننده زندگی است و سیستم عصبی مرکزی (CNS) را تحت تأثیر قرار می‌دهد و با التهاب مغز مشخص می‌شود، نسبتاً نادر است.
قارچ‌ها، باکتری‌ها و انگل‌ها قادر به ایجاد انسفالیت هستند؛ با این حال، ویروس‌ها هنوز علت اصلی این بیماری هستند. از میان عوامل ویروسی متعددی که قادر به ایجاد التهاب CNS هستند، شایع‌ترین پاتوژن‌هایی که کلینیسین‌ها با آنها مواجه می‌شوند، ویروس‌های انتریک، آربوویروس‌ها و همچنین اعضای خانواده ویروس هرپس انسانی (HHV) هستند. نقش ویروس‌های HHV-6 و HHV-7 در بیماری‌های CNS یک حوزه تحقیقاتی مداوم است.

ویروس‌های هرپس انسانی نوع 6 و 7 به جنس رزئولوویروس از زیرخانواده بتا هرپس‌ویروس تعلق دارند. ویروس هرپس انسانی نوع 6 به عنوان یک علت مننژیت و انسفالیت در کودکان و بزرگسالان شناخته شده است.
ویروس HHV-7 در حدود 75٪ از بزرگسالان سالم یافت می‌شود؛ اکثر انتقال ویروس از طریق بزاق صورت می‌گیرد. عفونت‌های ناشی از این ویروس‌ها عمدتاً در دوران کودکی رخ می‌دهند. دامنه تظاهرات CNS که به این ویروس‌ها نسبت داده می‌شود شامل عفونت بدون علامت، تشنج‌های تب‌دار، اختلالات تشنج، مننژیت، مننگوآنسفالیت، فلج صورت، نوریت دهلیزی، اختلالات میلین‌زدایی، همی‌پلژیک و به ندرت، انسفالیت کشنده است.
تشخیص اتولوژیک دقیق ضروری است زیرا درمان‌های مؤثر و ویروس-خاص (به عنوان مثال، آسیکلوویر، گانسیکلوویر و فوسکارنت) در دسترس هستند. جداسازی این ویروس‌ها با کشت CSF نتایج ضعیفی می‌دهد و روش انتخابی برای تشخیص ویروس اکنون PCR است.

مواد و روش‌ها:

یک مطالعه مقطعی/پیش‌رونده از سال 2007 تا 2009 در بخش عفونی اطفال بیمارستان رسول اکرم در تهران انجام شد. این مطالعه توسط کمیته اخلاق در مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی کودکان وابسته به دانشگاه علوم پزشکی تهران تأیید شد.
به عنوان یک قانون در کشور ما و کمیته اخلاق، تمامی بیماران برای انجام پانکسیون کمری (LP) باید فرم رضایت را قبل از LP امضا کنند. رضایت بیمار اخذ شد.

جمع‌آوری داده‌ها:

در ابتدا، یک پرسشنامه توسط پزشک مجاز برای هر مورد تکمیل شد (مانند سن، جنسیت، تحلیل همه نمونه‌های CSF، پارامترهای بیوشیمیایی، رنگ‌آمیزی گرم، کشت LPA و CSF در هر دو محیط کشت متداول و Bactec / یا PCR باکتریایی عمومی) و نتایج تشخیص نهایی.

تعریف مورد:

مننگوآنسفالیت آسپتیک به صورت بالینی به عنوان مننگوآنسفالیت با پارامترهایی مانند حداقل 10 گلبول سفید در میلی‌متر (غلبه سلول‌های مونونوکلئر)؛ عدم رشد باکتری در کشت / یا PCR باکتریایی عمومی منفی (در صورت نیاز) در CSF، تست آگلوتیناسیون لاتکس منفی و رنگ‌آمیزی مستقیم گرم برای باکتری در CSF منفی تعریف شد.

معیارهای خروج:

ما تمامی موارد با مننژیت باکتریایی که به عنوان علت تظاهرات CNS شناخته شده‌اند (تومور، تروما، سندرم گیلن باره، لوکمی، اختلالات متابولیک و غیره) و تشنج ساده تب‌دار با CSF نرمال را از مطالعه خارج کردیم.
150 نمونه CSF از کودکان با مننگوآنسفالیت آسپتیک گرفته شد. محدوده سنی بیماران 1-170 ماه؛ میانگین = 25.6 ± 29 ماه، 48.8٪ مرد؛ 51.2٪ زن. روش‌های متداول و محیط کشت BACTEC Ped Plus؛ تست‌های آگلوتیناسیون لاتکس؛ و در برخی موارد آزمایش‌های PCR باکتریایی عمومی استفاده شد. DNA ویروس‌های HHV-6 و HHV-7 در نمونه‌های CSF با استفاده از آزمون RT-PCR شناسایی شد.

استخراج DNA و تهیه مستر میکس:

DNA از 200 میکرولیتر CSF با استفاده از کیت PCR قالب خالص بالا (شرکت Roche Diagnostics GmbH، مانهایم، آلمان) طبق دستورالعمل سازنده استخراج شد. آماده‌سازی‌های DNA حاصل در دمای −80 درجه سانتی‌گراد نگهداری شد. برای ویروس‌های مرجع، سلول‌های آلوده در بافر لیز 2× لیز شدند. کنترل‌های منفی با تکرار پروتکل آماده‌سازی DNA تهیه شدند، اما CSF با آب مقطر جایگزین شد و سلول‌های آلوده با سلول‌های غیرآلوده جایگزین شدند. آزمون RT-PCR با استفاده از کیت Quant HHV-6 و HHV-7 Real –TM (شرکت Sacace Biotechnologies، ایتالیا) انجام شد.

تعیین مقدار DNA ویروس‌های HHV-6 و HHV-7:

روش PCR چندگانه که همزمان HHV-6 و HHV-7 را شناسایی می‌کند به کار گرفته شد، روشی که از پرایمرهایی استفاده می‌کند که بخشی از ژن U67 ویروس HHV-6 و ژن U42 ویروس HHV-7 را تکثیر می‌کنند، مخلوط واکنش در یک سیستم RT-PCR (Rotor Gene 6000، شرکت Corbett Research، استرالیا و ایالات متحده) قرار داده شد.
قبل از شروع آزمایش، لوله‌ها در دمای 95 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه نگه داشته شدند. نمونه‌ها سپس تحت 5 چرخه 30 ثانیه‌ای در دمای 95 درجه سانتی‌گراد، 30 ثانیه در دمای 60 درجه سانتی‌گراد و 60 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند. این مراحل به دنبال 40 چرخه 30 ثانیه‌ای در دمای 95 درجه سانتی‌گراد، 30 ثانیه در دمای 60 درجه سانتی‌گراد و 60 ثانیه در دمای 72 درجه سانتی‌گراد انجام شدند. منحنی‌های نوری فلورسانس در حین PCR ثبت شدند و داده‌ها با استفاده از نرم‌افزار مربوطه تحلیل شدند.

نتایج:

تحلیل آماری:

نتایج ما کمتر از نرخ سایر منابع بود اما بالاتر از یافته‌های مطالعه قبلی در ایران بود. این تفاوت ممکن است به دلیل تفاوت در روش‌ها، سن موارد مطالعه یا تفاوت‌های اپیدمیولوژیک و جغرافیایی باشد.
در طی مطالعه، از 150 بیمار مبتلا به مننگوآنسفالیت آسپتیک، 12٪ (18/150) دارای DNA ویروس‌های هرپس انسانی نوع 6 و 7 در نمونه‌های CSF خود بودند.
DNA ویروس HHV-6 در 7 مورد (4.7٪) شناسایی شد و DNA ویروس HHV-7 در 2 مورد (1.4٪) شناسایی شد. DNA ویروس‌های هرپس انسانی نوع 6 و 7 در 6٪ از کل موارد شناسایی شدند. ویروس HHV-6 کمی بیشتر از HHV-7 مشاهده شد.

بحث و نتیجه‌گیری:

پژوهش حاضر بر حضور DNA ویروس‌های HHV-6 و HHV-7 در نمونه‌های CSF از بیماران ایرانی مبتلا به مننگوآنسفالیت آسپتیک تمرکز دارد. در این مطالعه، میزان شناسایی این ویروس‌ها پایین‌تر از سایر گزارش‌ها بود، اما بالاتر از یافته‌های مطالعات قبلی در ایران بود. این تفاوت‌ها ممکن است به دلیل تفاوت‌های روش‌شناسی، سن موارد مطالعه، و یا تفاوت‌های اپیدمیولوژیک و جغرافیایی باشد.

تشخیص دقیق این ویروس‌ها به دلیل دسترسی به درمان‌های مؤثر و خاص ویروس بسیار مهم است. جداسازی این ویروس‌ها با استفاده از کشت CSF نتایج ضعیفی می‌دهد و روش انتخابی برای تشخیص ویروس PCR است.

این مطالعه توسط مرکز تحقیقات بیماری‌های عفونی کودکان دانشگاه علوم پزشکی تهران و همچنین بیمارستان رسول اکرم تهران پشتیبانی شد.