شیوع ورم ملتحمه آدنوویروسی در بیماران مراجعه‌کننده به بیمارستان وابسته به دانشگاه علوم پزشکی ایران

شعبانی-شهرآبادی م1، موسوی ا1، منوری ش2، عطایی-پیرکوه ا1، بختیاری پ3

گروه ویروس‌شناسی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران.

گروه ویروس‌شناسی و مرکز تحقیقات مقاومت میکروبی، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران.

گروه چشم‌پزشکی، بیمارستان رسول اکرم، دانشگاه علوم پزشکی ایران، تهران، ایران.

چکیده

مقدمه و اهداف: آدنوویروس یکی از عوامل ایجادکننده ورم ملتحمه ویروسی است. تقریباً 40٪ از موارد ورم ملتحمه ویروسی به عفونت آدنوویروس نسبت داده می‌شود. میزان عفونت معمولاً در ماه‌های بهار و تابستان بیشتر است.
در این مطالعه تلاش شده است تا شیوع ورم ملتحمه ناشی از عفونت آدنوویروس در بیمارانی که به یکی از بیمارستان‌های وابسته به دانشگاه علوم پزشکی ایران مراجعه کرده‌اند با استفاده از روش‌های ویروس‌شناسی مورد بررسی قرار گیرد.

مواد و روش‌ها: نمونه‌ها از بیماران با علائم بالینی ورم ملتحمه با استفاده از سواب جمع‌آوری شد. نمونه‌ها پردازش و با استفاده از تکنیک‌های کشت سلولی و واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) مورد آزمایش قرار گرفتند.

نتایج: از 100 نمونه گرفته شده، 16٪ از آنها با روش PCR مثبت بودند. از این نمونه‌ها، تنها 8٪ رشد ویروسی در کشت سلولی نشان دادند. تفاوتی در میزان عفونت بین گروه‌های جنسی مشاهده نشد، اما بیشتر موارد در بیماران 17 تا 27 ساله و در ماه‌های مارس تا مه اتفاق افتاده بود.

نتیجه‌ گیری: نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که آدنوویروس نقش مهمی به عنوان عامل ایجادکننده ورم ملتحمه ایفا می‌کند.

واژه‌های کلیدی: آدنوویروس، ورم ملتحمه، کشت سلولی، واکنش زنجیره‌ای پلیمراز

مقدمه

آدنوویروس‌ها شایع‌ترین عامل ایجاد ورم ملتحمه ویروسی در سراسر جهان هستند. شیوع ورم ملتحمه آدنوویروسی بین 15٪ تا 70٪ از تمام موارد ورم ملتحمه را در سراسر جهان تشکیل می‌دهد.
این ویروس‌ها به شش زیرگروه و 51 سروتیپ تقسیم می‌شوند. حدود یک سوم از سروتیپ‌های آدنوویروس انسانی با عفونت‌های چشمی مرتبط هستند. شایع‌ترین سروتیپ‌های ایجادکننده ورم ملتحمه حاد شامل سروتیپ‌های 3، 4، 8، 11، 19 و 37 می‌باشند.

تشخیص عفونت‌های آدنوویروسی به طور معمول بر اساس تاریخچه بیمار، علائم و نشانه‌های بالینی انجام می‌شود. با این حال، تشخیص تفاوت بین ورم ملتحمه باکتریایی و ویروسی گاهی دشوار است. تکنیک‌های سنتی تشخیص ورم ملتحمه ویروسی شامل بررسی سیتولوژی ملتحمه‌ای و تلقیح خطوط سلولی مستعد با نمونه گرفته شده از چشم آلوده و مشاهده اثرات سیتوپاتیک است. اگرچه این تکنیک‌ها پرهزینه و زمان‌بر هستند، اما به دلیل قطعی بودن جداسازی عامل عفونی، به عنوان استاندارد طلایی باقی می‌مانند.

در دو دهه اخیر، تکنیک واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) به طور گسترده‌ای برای تشخیص عفونت آدنوویروسی در چشم‌پزشکی بالینی استفاده شده است. این تکنیک حساس‌تر، دقیق‌تر و کم‌هزینه‌تر از کشت سلولی برای تشخیص آدنوویروس در موارد ورم ملتحمه است. با توجه به اینکه عفونت‌های چشمی آدنوویروسی در سراسر جهان به صورت پراکنده و اپیدمیک رخ می‌دهد، تصمیم گرفته شد تا شیوع ورم ملتحمه آدنوویروسی با استفاده از ترکیبی از تکنیک‌های کشت سلولی و PCR در نمونه‌های گرفته شده از بیماران مراجعه‌کننده به بخش چشم‌پزشکی بیمارستان رسول اکرم بررسی شود.

روش‌ها

جمع‌آوری نمونه‌ها

بیمارانی که با علائم بالینی ورم ملتحمه به کلینیک چشم‌پزشکی بیمارستان رسول اکرم، دانشگاه علوم پزشکی ایران، در طول یک دوره 6 ماهه از ژانویه تا اول ژوئیه 2007 مراجعه کردند، مورد بررسی قرار گرفتند. بیماران توسط متخصص معاینه شدند و دو نمونه از هر بیمار با استفاده از دو سواب داکرون استریل گرفته شد. سواب‌ها به طور جداگانه در دو لوله پلی‌استایرن استریل که هر کدام حاوی 1 میلی‌لیتر محیط انتقال (DMEM) بودند، قرار داده شدند. لوله‌ها در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگهداری و در کیف سرد به آزمایشگاه تحویل داده شدند، جایی که تا زمان استفاده در دمای 70- درجه سانتی‌گراد نگهداری می‌شدند. در مجموع 100 بیمار نمونه‌گیری شدند.

کشت سلولی

سلول‌های HeLa به صورت تک‌لایه در فلاسک‌های کشت یکبار مصرف حاوی محیط کشت حداقل ضروری Dulbecco (DMEM) با آنتی‌بیوتیک‌ها و 5٪ سرم گوساله جنین کشت داده شدند. فلاسک‌ها در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در جوی حاوی 5٪ CO2 نگهداری شدند. برای مقایسه، سلول‌های Vero نیز به طور مشابه کشت داده شدند و برای جداسازی ویروس استفاده شدند.

جداسازی ویروس

سلول‌های HeLa به صورت تک‌لایه در میکروپلیت‌های کشت بافت 24 چاهک کشت داده شدند. سلول‌ها در DMEM با 5٪ FCS نگهداری شدند و در دمای 37 درجه سانتی‌گراد در جوی حاوی 5٪ CO2 انکوبه شدند.
نمونه‌های بالینی در محیط انتقال در میکروفیوژ به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ شدند. سوپرانتانت حفظ شد و 100 میکرولیتر از آن به هر چاهک تک‌لایه سلولی تلقیح شد و به مدت 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد جذب شد. سلول‌های تلقیح شده تحت شرایط فوق نگهداری و روزانه برای مشاهده اثرات سیتوپاتیک (CPE) بررسی شدند.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)

DNA از نمونه‌های بالینی با استفاده از روش استخراج فنل کلروفرم استخراج شد. پرایمرها از ژن هگزون آدنوویروس طراحی شده بودند و توالی آن‌ها به شرح زیر بود:

• ADRJC1 (5′-GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA-3′)
• ADRJC2 (3′-ATGGACGCGTGGGGAAGAGTCGCC-5′)

سیکلاتور حرارتی برای یک سیکل اولیه در 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، 55 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه برنامه‌ریزی شد. پس از آن 40 سیکل با دمای 94 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه، 55 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 دقیقه و 72 درجه سانتی‌گراد به مدت 1.5 دقیقه انجام شد. محصولات PCR بر روی ژل آگارز 2٪ حاوی اتیدیوم برومید الکتروفورز شدند. باندها با استفاده از ترانس‌ایلومیناتور فرابنفش مشاهده شدند. تحلیل داده‌ها با استفاده از آزمون کای دو و آزمون T در نرم‌افزار SPSS (نسخه 16) انجام شد.

نتایج

در طول دوره 6 ماهه از ابتدای ژانویه تا اول ژوئیه 2009-2010، 100 نمونه از چشم‌های بیماران با احتمال ورم ملتحمه ویروسی گرفته شد. جمعیت مطالعه شامل 45 زن و 55 مرد بود. حداقل سن بیماران 2 سال و حداکثر سن 77 سال بود، با میانگین سن 29.25 سال. علائم بالینی بیماران در جدول 3 نشان داده شده است.

آزمون PCR

DNA از همه نمونه‌ها استخراج شده و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی آدنوویروس تحت آزمون PCR قرار گرفت. از مجموع 100 نمونه آزمایش شده، 16 نمونه با آزمون PCR مثبت بودند. نمونه‌های مثبت باند DNA با اندازه معادل 150 جفت باز را نشان دادند

بحث

اگرچه ورم ملتحمه به طور معمول توسط ویروس‌ها، باکتری‌ها و آلرژن‌ها ایجاد می‌شود، نتایج مطالعه ما نشان داد که عفونت آدنوویروس شایع‌ترین علت ورم ملتحمه در بیمارانی است که به بیمارستان مراجعه می‌کنند. مطالعه ما نشان داد که 16٪ از نمونه‌ها با استفاده از آزمون PCR برای آدنوویروس مثبت بودند. کشت سلولی تنها 8٪ موارد مثبت را نشان داد. این یافته‌ها با مطالعه انجام شده توسط Aoki و Tagawa در ژاپن سازگار است، که نشان داد 11.9٪ از موارد ورم ملتحمه ویروسی به عفونت آدنوویروس نسبت داده می‌شود.

واکنش زنجیره‌ای پلیمراز به دلیل دقت و سرعت بالا در تشخیص عفونت‌های ویروسی جایگاه مهمی پیدا کرده است. کشت سلولی، هرچند که به عنوان استاندارد طلایی در نظر گرفته می‌شود، زمان‌بر و پرهزینه است. بنابراین، استفاده از تکنیک‌های سریع و قابل اعتماد مانند PCR برای تشخیص آدنوویروس اهمیت دارد. اخیراً، اداره غذا و داروی آمریکا یک تست تشخیصی سریع (RPS) را برای تشخیص ورم ملتحمه آدنوویروسی تأیید کرده است. یک مطالعه بالینی نشان داد که این تست دارای حساسیت 89٪ و ویژگی 94٪ در مقایسه با PCR است، در حالی که کشت سلولی 91٪ حساسیت و 100٪ ویژگی را نشان داد.

نتیجه‌گیری

استفاده از تکنیک‌های سریع و دقیق مانند PCR و دستگاه تشخیص سریع عوامل بیماری‌زا (RPS) برای تشخیص ورم ملتحمه آدنوویروسی می‌تواند به کاهش انتشار بیماری و جلوگیری از درمان‌های غیرضروری آنتی‌بیوتیکی کمک کند. نتایج این مطالعه اهمیت استفاده از روش‌های تشخیصی سریع و قابل اعتماد را در کنترل و مدیریت عفونت‌های چشمی آدنوویروسی نشان می‌دهد.